1 适用范围
本操作方法适用配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
2 原理
样品在水溶液中，加入过量硫酸铜，在碱性条件下，纯蛋白被氢氧化铜沉淀， 用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的测定方法测定其含氮量。
3 试剂
3.1 10%硫酸铜溶液：
称取五水硫酸铜 10g 用水溶解，转移至 100ml 容量瓶中定容至刻度。
3.2 2.5%氢氧化钠溶液：
称取 2.5g 氢氧化钠用水溶解，转移至 100ml 容量瓶中定容至刻度。
3.3 硫酸：化学纯，含量为 98%，无氮。
3.4 催化剂：0.4g 硫酸铜，5 个结晶水，6g 硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。
3.5 氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（M/V）。
3.5.1 配制方法：
500g 氢氧化钠+1100ml 蒸馏水。
3.6 硼酸：化学纯，2%水溶液（M/V）。
3.6.1 配制方法：
20.5g 硼酸+1000ml 蒸馏水。
3.7 混合指示剂：
甲基红，1%乙醇溶液，溴甲酚绿，0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
3.7.1 溴甲酚绿，0.5%乙醇溶液配置：
溴甲酚绿 0.125g+25ml 乙醇。
3.7.2 甲基红，1%乙醇溶液配置：
甲基红 0.025g+25ml 乙醇。
3.8 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按 GB/T601 制备。
3.8.1 0.02mol/L 盐酸标准溶液：1.67ml 盐酸，分析纯，注入 1000ml 蒸馏水中。
3.8.2 0.1mol/L 盐酸标准溶液：8.3ml 盐酸，分析纯，注入 1000ml 蒸馏水中。
3.9 硫酸铵：分析纯，干燥。
3.10 蔗糖：分析纯。
4 仪器设备
4.1 实验室用样品粉碎机。
4.2 分样筛：孔径 0.45mm（40 目）。
4.3 分析天平：感量 0.0001g。
4.4 电炉。
4.5 滴定管：酸式，25、50ml。
4.6 凯氏烧瓶：
250ml。
4.7 凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。
4.8 锥形瓶：250ml。
4.9 容量瓶：100ml。
4.10 烧杯：200ml。
4.11 干燥箱。
5 分析步骤
5.1 半微量法
5.1.1 样品的处理
称取待测样品 0.5-1g（精确到 0.1mg）于 200ml（4.10）烧杯中，加入 50ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，在电炉（4.4）上加热煮沸，加入 20ml 10%硫酸铜溶液（3.1），再加入 20ml 2.5%氢氧化钠溶液（3.2）搅匀，从电炉上取下，在室温放置 2h，然后用倾泻法将样品过滤到滤纸上，用少量温水多次洗涤烧杯和沉淀物，直至洗出液无硫酸根离子（用 10%氯化钡溶液来检验滤液无沉淀），连同漏斗一起放入 80℃干燥箱（4.11）中烘干，将滤纸和沉淀物小心放入 250ml凯氏烧瓶（4.6）中，加入 6.4g 催化剂（3.4），20ml 浓硫酸（3.3），在电炉（4.4）上消化，样液澄清后继续消煮 2h，取下冷却后加入 20ml 蒸馏水，转入100ml 容量瓶（4.9）中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。同时做空白实验。
5.1.2 蒸馏
将半微量蒸馏装置（4.7）的冷凝管末端浸入装有 20ml 硼酸（3.6）的吸收液和 2 滴混合指示剂（3.7）的锥形瓶（4.8）内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液 10-20ml 注入蒸馏装置中，小心提起玻璃塞使之流入反应室，同时用蒸馏水冲洗蒸馏装置入口内壁使样品分析液和冲洗液一并流入反应室，迅速将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏 4min 降下锥形瓶使冷凝管末端离开液面，再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
5.1.3 滴定
蒸馏后的吸收液立即用 0.02 mol/L 盐酸标准溶液（3.8.1）滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
5.2 常量法
5.2.1 称取待测样品 0.5-1g（精确到 0.1mg）于 200ml（4.10）烧杯中，加 50ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，在电炉（4.4）上加热煮沸，加入 20ml10%硫酸铜溶液（3.1），再加入 20ml2.5%氢氧化钠溶液（3.2）搅匀，从电炉上取下，在室温放置 2h，然后用倾泻法将样品过滤到滤纸上，用少量温水多次涤烧杯和沉淀物，直至洗出液无硫酸根离子（10%氯化钡溶液来检验滤液无沉淀），连同漏斗一起放入 80℃干燥箱内烘干，将滤液和沉淀物小心放入 250ml 凯氏烧瓶（4.6）中，加入 6.4g 催化剂（3.4），20ml 浓硫酸（3.3），在电炉上消化，样液澄清后继续消煮 2h，取下放冷后加入 60-100ml 蒸馏水，摇匀冷却。同时做空白实验。
5.2.2 将蒸馏装置（4.7）的冷凝管末浸入装有 25ml 硼酸（3.6）吸收液和 2 滴混合指示剂（3.7）的锥形瓶内。然后小心的向凯氏烧瓶（4.6）中加入 50ml氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液为100ml，降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏 1-2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
5.2.3 滴定
蒸馏后的吸收液立即用 0.1mol/L 盐酸标准溶液（3.8.2）滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
5.3 蒸馏步骤的检验
精确称取 0.2g 硫酸铵（3.9）代替试样，按 5.1 或 5.2 步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为 21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
5.4 空白测定
称取蔗糖（3.10）0.5g，代替试样，按 5.1 或 5.2 步骤进行空白测定，消耗0.1mol/L 盐酸标准溶液（3.8.2）的体积不得超过 0.2ml。消耗 0.02mol/L 盐酸标准溶液（3.8.1）体积不得超过 0.3ml。
6 分析结果的表述
6.1 计算见下式：
真蛋白（%）=(V1-V2)×C×0.0140×6.25×100
m×V′/V
V1-滴定试样时所需标准溶液的体积,ml；
V2-滴定空白时所需标准溶液的体积,ml；
C-盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
V-试样分解液的总体积，ml；
V′-试样分解液蒸馏用体积，ml；
0.0140-每毫克当量氮的克数；
6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。
6.2 重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。当真蛋白含量在25%以上时，允许相对偏差为 1%。
当真蛋白含量在 10%-25%之间时，允许相对偏差为 2%。当真蛋白含量在 10%以下时，允许相对偏差为 3%。
7 关键步骤及注意事项
7.1 倾泻法过滤洗涤时，烧杯中的沉淀物一定要彻底清洗。室温较低时洗涤用水的温度要稍微高一点，以保证烧杯中的沉淀物彻底转移。
7.2 过滤时的滤液达到 400ml 后再用 10%的氯化钡溶液检验滤液是否有沉淀，这样可以减少检验次数。
7.3 烘干沉淀时，可将滤液倒掉，将漏斗和盛放滤液的容器同时放入干燥箱，以免漏斗放置不稳沉淀物遗失。
7.4 加入混合催化剂在电炉上消化时，要时刻观察样液的颜色变化（有些单一饲料中含杂质较多不易观察颜色），样液彻底澄清后再计时继续消煮 2h。
7.5 半微量法测定真蛋白转移时要遵循少量多次的原则，一方面转移的溶液体积不超过 100ml ，也要做到转移彻底。
烘干按常规测定。