附 录 A (规范性附录)
饲料中粗蛋白测定方法 GB/T 6432—1994 本标准参照采用 ISO 5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。
A.1 主要内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
A.2 引用标准 GB 601
化学试剂
滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备 A.3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量,即在催化剂作用下,用硫酸破坏有机物,使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,测出氮含量,乘以换算系数 6.25,计算出粗蛋白含量。
A.4 试剂 A.4.1 硫酸(GB 625):化学纯,含量为98%,无氮。
A.4.2 混合催化剂:0.4g五水硫酸铜,6g硫酸钾或无水硫酸钠,均为化学纯,磨碎混匀。
A.4.3 氢氧化钠(GB 629):化学纯,40%水溶液( M / V )。
A.4.4 硼酸(GB 628):化学纯,2%水溶液( M / V )。
A.4.5 混合指示剂:甲基红0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿0.5%乙醇溶液,两溶液等体积混合,在阴凉处保存期为三个月。
A.4.6 盐酸标准溶液:邻苯二甲酸氢钾法标定。
A.4.7 0.1mol/L盐酸(HCL)标准溶液:8.3mL盐酸(GB 622),分析纯,注入1000mL蒸馏水中。
A.4.8 0.2mol/L盐酸(HCL)标准溶液:1.67mL盐酸(GB 622),分析纯,注入1000mL蒸馏水中。
A.4.9 蔗糖(HG 3-1001):分析纯。
A.4.10 硫酸铵(GB 1396):分析纯,干燥。
A.4.11 硼酸吸收液:1%硼酸水溶液1000mL,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL,0.1%甲基红乙醇溶液7mL,4%氢氧化钠水溶液0.5mL,混合,置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。
A.5 仪器设备 A.5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。
A.5.2 分样筛:孔径0.42mm(40目)。
A.5.3 分析天平:感量0.0001g。
A.5.4 消煮炉或电炉。
A.5.5 滴定管:酸式(A级),10、25mL。
A.5.6 凯氏烧瓶:250mL。
A.5.7 凯氏蒸馏装置:常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。
A.5.8 锥形瓶:150、250mL。
A.5.9 容量瓶:100mL。
A.5.10 消煮管:250mL。
A.5.11 定氮仪:以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白测定仪。
A.6 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至 200g,粉碎后全部通过 40 目筛,装于密封容器中,防止试样成分的变化。
A.7 分析步骤 A.7.1 试样的消煮 称取试样 0.5g~1g(含氮量 5mg~80mg)准确至 0.0002g,无损失地放入凯氏烧瓶中,加入 6.4g 混合催化剂与试样混合均匀,再加入 12mL 硫酸和 2 粒玻璃珠,将凯氏烧瓶置于电炉上加热,开始小火,待样品焦化,泡沫消失后,再加强火力直至呈透明的蓝绿色,然后再继续加热,至少 2h。
A.7.2 氨的蒸馏 A.7.2.1 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却,加入60mL~80mL蒸馏水,摇匀,冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50mL氢氧化钠,轻轻摇动凯氏烧瓶,使溶液混匀后再加热蒸馏,直至流出体积为100mL。降下锥形瓶,使冷凝管末端离开液面,继续蒸馏1min~2min,并用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形内,然后停止蒸馏。
A.7.2.2 半微量蒸馏法 将试样消煮液冷却,加入 20mL 蒸馏水,转入 100mL 容量瓶中,冷却后用水稀释至刻度,摇匀,做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有 20mL 硼酸吸收液和 2 滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指标剂数滴,硫酸数滴,在蒸馏过程中保持此液为橙红色,否则需补加硫酸。准确移取试样分解液 10mL~20mL 注入蒸馏装置的反应室中,用少量蒸馏水冲洗进样入口,塞好入口玻璃塞,再加 10mL 氢氧化钠溶液,小心提起玻璃塞使之流入反应室,将玻璃塞塞好,且在入口处加水密封,防止漏气。蒸馏 4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面,再蒸馏 1min,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏。
A.7.2.3 蒸馏步骤的检验 精确称取 0.2g 硫酸铵,代替试样,按 7.2.1 或 7.2.2 步骤进行操作,测得硫酸铵含氮量为 21.19%±0.2%,否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
A.7.3 滴定 用 7.2.1 法蒸馏后的吸收液立即用 0.1mol/L 或 0.02mol/L 盐酸标准溶液滴定,溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
A.8 空白测定 称取蔗糖 0.5g,代替试样,按 5 测定步骤进行空白测定,消耗 0.1mol/L 盐酸标准溶液的体积不得超过 0.2mL。消耗 0.02mol/L 盐酸标准溶液体积不得超过 0.3mL。
A.9 分析结果的表述
A.9.1 计算见下式:
式中:
V 2 ——滴定试样时所需标准酸溶液体积,mL;
V 1 ——滴定空白时所需标准酸溶液体积,mL;
C ——盐酸标准溶液浓度,mol/L;
m ——试样质量,g;
V——试样分解液总体积,mL;
V ′ ——试样分解液蒸馏用体积,mL; 0.0140——与 1.00ml 盐酸标准溶液[c(HCL)=1.000mol/L]相当的、以克表示的氮的质量。
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。
3.饲料中粗蛋白的测定
1 适用范围 本方法适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中粗蛋白含量的测定。
2 原理
各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如 CuSO 4 ,K 2 SO 4 或 Na 2 SO 4 或 Se 粉)的帮助下,用浓硫酸进行消化作用,使蛋白质和其它有机态氮(在一定处理下也包括硝酸态氨)都转变成 NH 4 + 并与 H 2 SO 4 化合成(NH 4 )
2 SO 4 ,而非含氮物质,则以 CO 2
↑,H 2 O↑,SO 2 ↑状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏,释放出的铵态氮,用硼酸溶液吸收并与之结合成为四硼酸铵,然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂,用 HCl 标准溶液( 0.1mol/L)滴定,求出氮的含量,根据不同的饲料再乘以一定的系数(通常用 6.25 系数计算),即为粗蛋白质的含量。
其主要化学反应如下:
1、2NH 4 (CH 2 )
2 COOH+13H 2 SO 4 →(NH 4 )2SO 4 +6CO 2 +12SO 2 +16H 2 (丙氨酸)
2、(NH 4 )2SO 4
+2NaOH→2NH 3 +3H 2 O+2Na 2 SO 4
3、4H 3 BO 3 + NH 3 →NH 4 HB 4 O 7 +5H 2 O
4、NH 4 HB 4 O 7 +HCl+5H 2 O→NH 4 C1+4H 3 BO 3
本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮,只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。在测定结果中除蛋白质外,还有氨基酸、酰胺、铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等,故以粗蛋白质表示之。
3 试剂 3.1 硫酸:化学纯,含量为 98%,无氮; 3.2 混合催化剂:0.4g 硫酸铜,5 个结晶水,6g 硫酸钾或硫酸钠,均为化学纯,磨碎混匀; 3.3 氢氧化钠:化学纯,40%水溶液(m/V); 3.4 硼酸:化学纯,2%水溶液(m/V); 3.5 混合指示剂:甲基红 0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿 0.5%乙醇溶液,两溶液等体积混合,在阴凉处保存期为三个月; 3.6. 盐酸标准溶液:0.1mol/L; 3.7 蔗糖:分析纯; 3.8 硫酸铵:分析纯,干燥; 3.9 硼酸吸收液:1%硼酸水溶液 1000mL,加入 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 10mL,0.1%甲基红乙醇溶液 7mL,4%氢氧化钠水溶液 0.5mL,混合,置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。
4 仪器设备 4.1 实验室用样品粉碎机或研钵; 4.2 分样筛:孔径 0.45 mm(40 目); 4.3 分析天平:感量 0.0001 g; 4.4 消煮炉; 4.5 滴定管:酸式,10、25 mL; 4.6 凯氏蒸馏装置:常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式; 4.7 锥形瓶:150、250 mL; 4.8 消煮管:250 mL; 4.9 定氮仪:以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。
5 分析步骤
5.1 全量法 5.1.1 试样的消煮 称取试样 0.2~0.5g(玉米、小麦称 0.7~1.0g;豆粕称 0.4g;鱼粉、羽毛粉称 0.3g),精确至 0.0002g,放入消化管中,加 2 片消化片(硒粉和硫酸钾混合物,市场上有成品)或 6.4g 混合催化剂,13 ml 浓硫酸,于 420℃下在消化炉上消化至消化管内呈现蓝色时继续消化 40min。取出冷却后加入 30 ml 蒸馏水。
5.1.2 氨的蒸馏 采用全自动定氮仪时,按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪时,将带消化液的消化管插在蒸馏装置上,以 30 mL 硼酸为吸收液,加入 2 滴混合指示剂,蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内,然后向消化管中加入约 50 mL 氢氧化钠溶液至消化管内液体呈黑色,进行蒸馏。吸收液体积达到 150 mL 时,停止蒸馏,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶内。
5.1.3 滴定 用 0.1 mol/L 的标准盐酸溶液滴定吸收液,溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
6 空白测定 称取蔗糖 0.5g,代替试样,进行空白测定,消耗 0.1 mol/L 盐酸标准溶液的体积不得超过 0.2 mL。
7 分析结果的计算和表述 计算见下式:
蛋白质(%)=
式中:V 2 ──滴定试样时所需标准酸溶液体积,mL;
V 1 ──滴定空白时所需标准酸溶液体积,mL;
c──盐酸标准溶液浓度,mol/L;
m──试样质量,g
0.0140──与 1.00 mL 盐酸标准液[c(HCl)=1.000 mol/L]相当的、以克表示的氮的质量。
6.25──氮换算成蛋白质的平均系数。
8 重复性
当粗蛋白质含量在 25%以上时,允许相对偏差为 1%。
当粗蛋白质含量在 10%~25%之间时,允许相对偏差为 2%。
当粗蛋白质含量在 10%以下时,允许相对偏差为 3%。
9 注意事项 9..1 消化要在通风橱中进行。
9..2 定氮仪不能漏气。
10 结果准确度的保证和评价 10.1 结果准确度的保证 10.1.1 如果是新的可调节电炉可适当调节其温度,消化时间据实际情况而定。
10.1.2 每次做空白试验较正装置。
10.1.3 定期做测定回收率实验 具体方法:精确称取 0.2g 硫酸铵,代替试样,用全量法“氨的蒸馏”中的步骤进行操作,测得硫酸铵含氮量为 21.19±0.2%,否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
10.1.4 蒸馏后的液体不能放置太长时间,要及时滴定。
10.1.5 消化温度应控制在 400℃~420℃内。消化器控温器应良好,电阻丝应使用专用配套电阻丝,拉伸应均匀,使炉内温度均匀。
10.1.6 蒸馏完毕应先取下接受瓶,然后在关闭电源,以免酸液倒流。
10.2 准确度的评价 10.2.1 测定回收率 10.2.1.1 加硫酸铵检测回收率,如果合格,说明蒸馏装置不漏气和盐酸标准溶液溶液标定正确。具体方法见 10.1.3 定期测回收率实验。
10.2.1.2 用已知含氮量的样品标准物(如含氮量在 1.30%~1.40%之间的玉米粉)用半微量法或推荐法测定其含氮量,和标准物质含氮量进行比对,要求测定结果在要求范围之内。此方法可以评价整个过程的准确度。
10.2.2 实验室比对 和国家认证的实验进行同样品实验数据比对。此方法可以评价整个过程的准确度。分公司对饲料中粗蛋白数据可疑样品应送集团质检中心复测。